Microscopía

CAPÍTULO 3
LA IMAGEN. SISTEMAS ÓPTICOS.

3.4.1.-Aumento

3.4.2.-Resolución

3.4.3.-Factores que determinan el poder de resolución

3.5.-Factores que limitan la resolución en un sistema de formación de imágenes

Los sistemas ópticos y habitualmente los microscopios pueden presentar errores que producen distorsión de las imágenes. Son producidos mediante varios mecanismos, ya sea por el comportamiento de la luz al incidir sobre el objeto en estudio o ya sea por defectos propios de las lentes. Estos defectos son comunmente conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad de la superficie de la lente y son derivados de la interacción de la luz con dicha superficie (15). Estos defectos producen alteraciones de los detalles de las imágenes y se pueden presentar combinados. En la actualidad, con el uso de técnicas de manufactura moderna que han permitido la elaboración de lentes más efectivas, se ha logrado corregirlos en gran medida.

3.5.1.-Difracción

El término difracción viene del latín diffractus que significa quebrado. La difracción es el fenómeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo de una superficie se "dobla" desviandose del trayecto y no sigue su propagación en línea recta (58) (fig. 3-6).

Figura 3-6.-Cuando al luz pasa por una rendija, no sigue su trayecto en línea recta, se “dobla”, en otras palabras, se difracta. Tomado de Braun, E. Arquitectura de sólidos y líquidos (58).

En la trans-iluminación del objeto, las ondas luminosas encuentran obstáculos en su trayecto, lo que produce una expansión de la luz por la difracción y se obtiene una imagen borrosa que limita la capacidad de aumento útil de un microscopio. Por ejemplo, los detalles menores de media milésima de milímetro (0,5 µm) no pueden verse en la mayoría de los microscopios ópticos.

Al ser observado un objeto transparente al microscopio, cada detalle iluminado del mismo crea un patrón de difracción denominado disco de Airy. Este patrón esta formado por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados por anillos oscuros. Cuando dos detalles estan muy próximos entre sí se puede verlos separados sólo si los puntos centrales no están muy próximos o superpuestos. Mientras más pequeños sean los discos de Airy, mayor será la resolución en una imagen (fig. 3-7). Los objetivos con mayor apertura numérica producen discos de Airy más pequeños (12).

Figura 3-7.-Discos de Airy y resolución. (a,b,c) tamaño de los discos y su perfil de intensidad, que decrece de (a) hasta (c) relacionados con la apertura numérica a medida que aumenta. (d) dos discos de Airy superpuestos y (e) discos de Airy en el límite de resolución. Tomado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).

3.5.2.-Aberraciones

Hay varios tipos de aberraciones:

• De esfericidad, relacionadas con la forma esférica de la lente: Se producen por falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la lente cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan por el centro, las cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que inciden en la periferia son refractadas en mayor grado y convergen en diferentes puntos focales. Este es uno de los artificios más molestos y la imagen del objeto aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y nítida (fig. 3-8). Además de la lente, la lámina cubreobjeto empleada en la preparación histológica puede producir este tipo de aberración. Una lámina de calidad debe tener 0,17 mm de espesor para poder ser utilizada con las lentes objetivo de la mayoría de microscopios, de lo contrario produce una marcada aberración de esfericidad (13, 57).

Figura 3-8.-Aberración de esfericidad. Los rayos que inciden paralelamente al eje principal no convergen todos en un mismo punto. Los rayos de la periferia convergen más cerca de la lente. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59).

• Cromáticas, relacionadas con las variaciones en los índices de refracción de las diversas frecuencias (colores) que conforman la luz blanca visible: Cuando la luz blanca atravieza una lente, las diferentes frecuencias son refractadas de acuerdo a su frecuencia. Cada color tiene un camino y un foco diferente; la luz violeta es la más refractada y le siguen la azul, la verde y la roja, fenómeno tambien conocido como dispersión (fig. 3-9). La incapacidad de la lente de reunir nuevamente los rayos refractados en un punto focal común resulta en una discreta diferencia en el tamaño del objeto y en franjas de colores rodeando la imagen (43). Los sistemas ópticos que dan corregida esta aberración se denominan acromáticos.

Figura 3-9.-Aberración cromática. La luz blanca se descompone al atravezar la lente y las diversas longitudes de onda convergen en varios puntos focales diferentes. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59).

• Otras aberraciones geométricas: Incluyen una variedad de efectos, tales como: Astigmatismo: No se puede enfocar simultáneamente líneas verticales y horizontales.
Coma: Se produce una degradación de la imagen de un punto, se ve similar a un cometa.
Distorsión: Se manifiesta en la forma del objeto, afectando particularmente a los bordes. El objeto se ve en forma de barril o de corset.
Curvatura del campo: El campo se ve con bordes curvos, deformando la imagen.

3.5.3.-Corrección de las aberraciones de los objetivos

La óptica geométrica da las bases para aplicar métodos que permiten la corrección o compensación de las aberraciones. Uno de ellos es la reducción de la apertura de ángulo del haz de luz, de manera que se evitan los rayos incidentes en la periferia de las lentes.

Un procedimiento más complejo es la combinación de varias lentes que corrijan la aberración. Esto se aplica para la aberración cromática y fue propuesto por Chester More Hall en 1735 y aplicado algo más tarde en microscopios. La corrección de la aberración esférica fue resuelta por Joseph Jackson Lister en 1830.

Para corregir las aberraciones geométricas se fabrican objetivos planos o aplanáticos, detalle señalado con la etiqueta PLAN. Para la corrección de las aberraciones cromáticas se elaboran objetivos denominan acromáticos, los cuales corrigen el rojo y el azul. Los objetivos semiapocromáticos son acromáticos que tienen una mayor apertura numérica. Los objetivos apocromáticos corrigen los colores rojo, azul y además el verde. Estos últimos son los objetivos de mayor calidad (47).

En el ojo humano aparecen todo tipo de aberraciones, notablemente desenfoque (miopía e hipermetropía), astigmatismo, coma y curvatura de campo entre otras, debido a que en generalmente este sistema óptico trabaja con una apertura pupilar grande. Algunas se compensan de forma natural pero las más graves tales como el desenfoque y el astigmatismo se corrigen mediante lentes o cirugía.

AUTOEVALUACIÓN PARA EL CAPÍTULO 3: LA IMAGEN Y SISTEMAS ÓPTICOS

1. ¿Qué es una imagen?

2. ¿Cuáles son los elementos que se requieren para formar una imagen?

3. ¿Qué es una imagen real y cómo se obtiene?

4. ¿Qué es una imagen virtual y cómo se obtiene?

5. ¿Cuáles son las principales diferencias entre una imagen real y una imagen virtual?

6. ¿Qué es un sistema óptico y cómo está constituido? Cite algunos ejemplos.

7. ¿Qué es la microscopía y cuál es su fundamento?

8. ¿Mediante cuáles mecanismos es posible iluminar un objeto para ser observado al microscopio?

9. ¿En qué consiste la capacidad de aumento de las lentes ópticas y cómo se obtiene?

10. ¿Qué es el poder de resolución de un sistema óptico? Cite ejemplos.

11. ¿Cuáles son los factores que determinan el poder de resolución de un sistema óptico?

12. ¿Cuáles son los factores que limitan la resolución e interfieren con la obtención de imágenes de calidad en un sistema óptico?

LECTURA SUGERIDA PARA EL CAPÍTULO 3:

1. Principio de Huygens-Fresnel. Historias de la Ciencia. Recuperado en Noviembre 23, 2007, de la World Wide Web: http://www.historiasdelaciencia.com/?p=168

2. Wilson T., Friedrich M., Diaspro A. Basics of Light Microscopy & Imaging. GIT VERLAG GmbH & Co. KG.

3. Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center.


Inicio Introducción Capítulo 1: Limitaciones para el estudio de células y tejidos Capítulo 2: Nociones básicas de óptica Capítulo 3: La imagen. Sistemas ópticos Capítulo 4: El microscopio compuesto Capítulo 5: El microscopio electrónico Capítulo 6: Técnicas especiales de microscopía Capítulo 7: Nuevas tendencias Conclusiones Bibliografía Anexos	LA MICROSCOPÍA: HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS
	CAPÍTULO 3 LA IMAGEN. SISTEMAS ÓPTICOS. 3.1.-La imagen. Consideraciones 3.2.-Sistemas ópticos 3.3.-Fundamento de la microscopía 3.3.1.-Trans-iluminación 3.3.2.-Epi-iluminación 3.4.-Aumento y resolución 3.4.1.-Aumento 3.4.2.-Resolución 3.4.3.-Factores que determinan el poder de resolución 3.5.-Factores que limitan la resolución en un sistema de formación de imágenes Los sistemas ópticos y habitualmente los microscopios pueden presentar errores que producen distorsión de las imágenes. Son producidos mediante varios mecanismos, ya sea por el comportamiento de la luz al incidir sobre el objeto en estudio o ya sea por defectos propios de las lentes. Estos defectos son comunmente conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad de la superficie de la lente y son derivados de la interacción de la luz con dicha superficie (15). Estos defectos producen alteraciones de los detalles de las imágenes y se pueden presentar combinados. En la actualidad, con el uso de técnicas de manufactura moderna que han permitido la elaboración de lentes más efectivas, se ha logrado corregirlos en gran medida. 3.5.1.-Difracción El término difracción viene del latín diffractus que significa quebrado. La difracción es el fenómeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo de una superficie se "dobla" desviandose del trayecto y no sigue su propagación en línea recta (58) (fig. 3-6). Figura 3-6.-Cuando al luz pasa por una rendija, no sigue su trayecto en línea recta, se “dobla”, en otras palabras, se difracta. Tomado de Braun, E. Arquitectura de sólidos y líquidos (58). En la trans-iluminación del objeto, las ondas luminosas encuentran obstáculos en su trayecto, lo que produce una expansión de la luz por la difracción y se obtiene una imagen borrosa que limita la capacidad de aumento útil de un microscopio. Por ejemplo, los detalles menores de media milésima de milímetro (0,5 µm) no pueden verse en la mayoría de los microscopios ópticos. Al ser observado un objeto transparente al microscopio, cada detalle iluminado del mismo crea un patrón de difracción denominado disco de Airy. Este patrón esta formado por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados por anillos oscuros. Cuando dos detalles estan muy próximos entre sí se puede verlos separados sólo si los puntos centrales no están muy próximos o superpuestos. Mientras más pequeños sean los discos de Airy, mayor será la resolución en una imagen (fig. 3-7). Los objetivos con mayor apertura numérica producen discos de Airy más pequeños (12). Figura 3-7.-Discos de Airy y resolución. (a,b,c) tamaño de los discos y su perfil de intensidad, que decrece de (a) hasta (c) relacionados con la apertura numérica a medida que aumenta. (d) dos discos de Airy superpuestos y (e) discos de Airy en el límite de resolución. Tomado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15). 3.5.2.-Aberraciones Hay varios tipos de aberraciones: • De esfericidad, relacionadas con la forma esférica de la lente: Se producen por falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la lente cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan por el centro, las cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que inciden en la periferia son refractadas en mayor grado y convergen en diferentes puntos focales. Este es uno de los artificios más molestos y la imagen del objeto aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y nítida (fig. 3-8). Además de la lente, la lámina cubreobjeto empleada en la preparación histológica puede producir este tipo de aberración. Una lámina de calidad debe tener 0,17 mm de espesor para poder ser utilizada con las lentes objetivo de la mayoría de microscopios, de lo contrario produce una marcada aberración de esfericidad (13, 57). Figura 3-8.-Aberración de esfericidad. Los rayos que inciden paralelamente al eje principal no convergen todos en un mismo punto. Los rayos de la periferia convergen más cerca de la lente. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59). • Cromáticas, relacionadas con las variaciones en los índices de refracción de las diversas frecuencias (colores) que conforman la luz blanca visible: Cuando la luz blanca atravieza una lente, las diferentes frecuencias son refractadas de acuerdo a su frecuencia. Cada color tiene un camino y un foco diferente; la luz violeta es la más refractada y le siguen la azul, la verde y la roja, fenómeno tambien conocido como dispersión (fig. 3-9). La incapacidad de la lente de reunir nuevamente los rayos refractados en un punto focal común resulta en una discreta diferencia en el tamaño del objeto y en franjas de colores rodeando la imagen (43). Los sistemas ópticos que dan corregida esta aberración se denominan acromáticos. Figura 3-9.-Aberración cromática. La luz blanca se descompone al atravezar la lente y las diversas longitudes de onda convergen en varios puntos focales diferentes. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59). • Otras aberraciones geométricas: Incluyen una variedad de efectos, tales como: Astigmatismo: No se puede enfocar simultáneamente líneas verticales y horizontales. Coma: Se produce una degradación de la imagen de un punto, se ve similar a un cometa. Distorsión: Se manifiesta en la forma del objeto, afectando particularmente a los bordes. El objeto se ve en forma de barril o de corset. Curvatura del campo: El campo se ve con bordes curvos, deformando la imagen. 3.5.3.-Corrección de las aberraciones de los objetivos La óptica geométrica da las bases para aplicar métodos que permiten la corrección o compensación de las aberraciones. Uno de ellos es la reducción de la apertura de ángulo del haz de luz, de manera que se evitan los rayos incidentes en la periferia de las lentes. Un procedimiento más complejo es la combinación de varias lentes que corrijan la aberración. Esto se aplica para la aberración cromática y fue propuesto por Chester More Hall en 1735 y aplicado algo más tarde en microscopios. La corrección de la aberración esférica fue resuelta por Joseph Jackson Lister en 1830. Para corregir las aberraciones geométricas se fabrican objetivos planos o aplanáticos, detalle señalado con la etiqueta PLAN. Para la corrección de las aberraciones cromáticas se elaboran objetivos denominan acromáticos, los cuales corrigen el rojo y el azul. Los objetivos semiapocromáticos son acromáticos que tienen una mayor apertura numérica. Los objetivos apocromáticos corrigen los colores rojo, azul y además el verde. Estos últimos son los objetivos de mayor calidad (47). En el ojo humano aparecen todo tipo de aberraciones, notablemente desenfoque (miopía e hipermetropía), astigmatismo, coma y curvatura de campo entre otras, debido a que en generalmente este sistema óptico trabaja con una apertura pupilar grande. Algunas se compensan de forma natural pero las más graves tales como el desenfoque y el astigmatismo se corrigen mediante lentes o cirugía. AUTOEVALUACIÓN PARA EL CAPÍTULO 3: LA IMAGEN Y SISTEMAS ÓPTICOS 1. ¿Qué es una imagen? 2. ¿Cuáles son los elementos que se requieren para formar una imagen? 3. ¿Qué es una imagen real y cómo se obtiene? 4. ¿Qué es una imagen virtual y cómo se obtiene? 5. ¿Cuáles son las principales diferencias entre una imagen real y una imagen virtual? 6. ¿Qué es un sistema óptico y cómo está constituido? Cite algunos ejemplos. 7. ¿Qué es la microscopía y cuál es su fundamento? 8. ¿Mediante cuáles mecanismos es posible iluminar un objeto para ser observado al microscopio? 9. ¿En qué consiste la capacidad de aumento de las lentes ópticas y cómo se obtiene? 10. ¿Qué es el poder de resolución de un sistema óptico? Cite ejemplos. 11. ¿Cuáles son los factores que determinan el poder de resolución de un sistema óptico? 12. ¿Cuáles son los factores que limitan la resolución e interfieren con la obtención de imágenes de calidad en un sistema óptico? LECTURA SUGERIDA PARA EL CAPÍTULO 3: 1. Principio de Huygens-Fresnel. Historias de la Ciencia. Recuperado en Noviembre 23, 2007, de la World Wide Web: http://www.historiasdelaciencia.com/?p=168 2. Wilson T., Friedrich M., Diaspro A. Basics of Light Microscopy & Imaging. GIT VERLAG GmbH & Co. KG. 3. Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center.

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