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Técnicas Histológicas Básicas - Inmunohistoquímica - Cursos - Normas de Seguridad

Laboratorio de Técnicas Histológicas Básicas:

Renovado hace unos pocos años, este laboratorio es el sitio de realización de los preparados histológicos que se emplean como material de apoyo docente en la enseñanza de la Histología en pre-grado y post-grado.
Permanentemente se elaboran preparados de tejidos y órganos con la finalidad de mantener actualizado y completo el laminario que sirve para estudiar los contenidos y cumplir con los objetivos específicos del Programa Práctico de la asignatura para los estudiantes del primer año de Medicina y de las diversas especialidades clínicas que asisten a nuestra cátedra.
De igual manera, nuestro Laboratorio de Técnicas Histológicas Básicas sirve para prestar asesoría técnica, en cuanto a procesamiento de tejidos, a diversas dependencias de la Universidad de Los Andes.

Las muestras procesadas provienen del Departamento de Anatomía Patológica del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes y del Bioterio, entre otros.

- Lista de Preparados Histológicos:
Se emplean técnicas de coloración de rutina tales como Hematoxilina-Eosina, Tricrómicos, Impregnaciones argénticas, Técnicas Histoquímicas (ácido Peryódico de Schiff, Sudán, entre otros).

Amígdala Palatina
Ano
Aorta
Aparato de Golgi (Ganglio Raquídeo)
Aparato de Golgi (Intestino Delgado)
Apéndice cecal
Arteria Elástica
Astroglía (fibrosa y protoplásmica)
Bazo
Bola de Edema
Bulbo y Corteza Cerebral
Cardias
Cartílago Elástico
Cartílago Fibroso
Cartílago nasal
Células Planas
Cerebelo
Corazón
Cordón Umbilical
Conducto Hepático
Crestas ampulares
Diente
Duodeno
Encía
Epífisis
Epiplón
Esófago
Estomago
Faringe
Fosas Nasales
Fundus
Ganglio Linfático
Ganglio Raquídeo
Ganglio Simpático
Glándula Mamaria
Glándula Parótida
Glándula Suprarrenal
Glándula Paratiroides
Glándula Tiroides
Hígado
Hipófisis
Histiocitos
Hueso Fresco
Hueso Seco
Intestino ( Celulas caliciformes )
Intestino (Colon )
Intestino Delgado (Duodeno)
Intestino Delgado (Ileon)
Intestino Degado. (Yeyuno)
Labio
Lengua
Lipofuscina
Mecencéfalo
Médula Espinal
Médula ósea
Meiosis
Mesenquimático (tejido conectivo)

Microglía
Mitocondrias
Mitosis
Mucoso (tejido conectivo cordón umbilical)
Músculo Cardiaco
Músculo Estriado esquelético
Músculo liso
Nervio de sapo (no Disociado)
Nervio de sapo (Disociado)
Nervio Periférico
Oído
Ojo
Ojo (parte posterior)
Osificacion Endocondral
Osificación Endoconjuntiva
Ovario
Paladar Blando
Paladar Duro
Páncreas
Paquete Vasculo- Nervioso
Parótida
Párpado
Pasaje Anal
Pasaje Cardial
Pene
Pasaje Pilórico
Piel Axila
Piel Fina
Piel Tejido Conectivo Denso
Piel Feto
Piel Gruesa
Piel Gruesa
Placenta
Plexos Coroideos
Próstata
Pulmón
Recto
Riñón
Tejido Adiposo
Tejido Conectivo Elástico
Tejido Conectivo Fibroso
Tejido Conectivo Mesenquimático
Tendón
Tendón y Cartílago Fibroso
Testículo
Testículo y Epidídimo
Timo Joven
Timo Involucionado
Traquea
Trompa de Falopio
Uña
Uretra
Uréter
Útero
Vejiga Retraída
Vejiga Distendida
Vesícula Seminal

Procedimientos de Rutina

Fijación

Fijadores Químicos
Simples: Son sustancias químicas de estructura no compleja, que se mezclan con agua destilada para lograr la proporción adecuada. Ejemplos:
Ac. Acético
Alcohol etílico C2H5OH
Formaldehido H-CHO
Ac. Pícrico
Ac. Crómico
Dicromato de potasio K2Cr2O7
Bicloruro de Mercurio HgCl2
Tetraóxido de osmio OsO4
Glutaraldehido
Permanganato de potasio KMnO4

Compuestos o Mezclas fijadoras: Se originan por la combinación de varios de los fijadores químicos simples, y tienen usos particulares para los cuales fueron creados. Ejemplos:
Formol tamponado
Formol calcio
Líquido de Zenker
Líquido de Bouin
Líquido de Helly
Fijador de Carnoy
Líquido de Flemming
Zenker-formalina

Inclusión
En parafina u otro medio de inclusión
Es el procedimiento mas utilizado que se realiza para poder cortar los tejidos en secciones suficientemente delgadas que permitan el paso de la luz, de modo que los detalles finos puedan ser observados al microscopio. Aunque los tejidos adquieren cierta consistencia al ser sometidos a la fijación, por lo general continúan siendo demasiado blandos para poder cortarlos en láminas delgadas (para Microscopía óptica) o ultrafinas (para microscopia electrónica de transmisión); por lo tanto es necesario que la porción de tejido a estudiar sea infiltrada y englobada por una sustancia líquida o semilíquida, de modo que una vez solidificada adquiera la suficiente dureza para formar bloques que puedan cortarse.

Corte
Es el proceso que tiene como finalidad la obtención de cortes muy delgados del tejido o espécimen que se encuentra incluido o no. Este se realiza por medio de un instrumento llamado micrótomo.
Existen diversos tipos de micrótomos, siendo algunos adaptados para un trabajo especial. Generalmente se consideran cinco clases de micrótomos: Rotación,

Micrótomos de rotación, deslizamiento, balanceo, congelación, vibratomo y para cortes ultrafinos.

Coloración Hematoxilina-Eosina
Protocolo. Preparación de los colorantes

Hematoxilina
La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae de la corteza del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, para ser empleada como tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína.
Tras el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter fuertemente básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada o negruzca, dependiendo de la sal metálica utilizada.
La laca de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico, conocida también en forma genérica como hemalumbre.

Reactivos:
Alumbre de Amonio o de Potasio (mordiente) 50 g
Cristales de hematoxilina 1 g
Yodato de Sodio 0,2 g
Ácido cítrico 1 g
Hidrato de cloral (bactericida) 50 g
Agua destilada 1000 mL

Procedimiento:
- Calentar la mitad del volumen de agua destilada a una temperatura por debajo del punto de ebullición.
- Pesar el alumbre de amonio o de potasio y agregarlo al agua que se está calentando hasta que se disuelva.
- Pesar los cristales de hematoxilina y agregarlos hasta que se disuelvan (aproximadamente en 20 minutos).
- Agregar el resto del agua destilada.
- Pesar y agregar el ácido cítrico, dejar reposar por 10 minutos.
- Pesar y agregar el yodato de sodio, dejar reposar por 10 minutos.
- Pesar y agregar el hidrato de cloral, dejar reposar por 10 minutos.
- Envasar en frasco ámbar y almacenar en la oscuridad. Mientras más tiempo permanezca en depósito, el proceso de maduración del colorante será mejor y se obtendrán mejores resultados.

Eosina
La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que contienen (eosina Y: cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo).
En general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en las estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares.

Para la preparación de la eosina (solución madre), el procedimiento es el siguiente:
Solución “A”
Reactivos Cantidad
Eosina amarillenta (Y) 3 g
Alcohol etílico o isopropílico 300 mL
Agua destilada 200 mL

Solución “B”
Reactivo Cantidad
Biebrich escarlata 1 g
Agua destilada 100 mL

Procedimiento:
- Preparar las 2 soluciones por separado. Las dos soluciones constituyen la solución madre.
- Tomar 1 parte de la solución madre y 3 partes de alcohol al 70 %.
- Agregar 3 –6 gotas de ácido acético.

Método de la Hematoxilina-Eosina
Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina (generalmente se emplea la de Harris, aunque también se emplean la de Mayer y la de Ehrlich). Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina, y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina.

Procedimiento Técnico:
Soluciones:
- Xilol
- Alcohol isopropílico al 95 %
- Agua corriente
- Hematoxilina
- Eosina
- Xilol/Alcohol

Protocolo:
- Después del desparafinaje, 3 baños en alcohol isopropílico al 95 % (3 recipientes distintos), el último baño debe ser el más prolongado (5 minutos).
- Baño en agua corriente durante 2-3 minutos, agitar suavemente.
- Baño en hematoxilina por 5 minutos
- Baño en agua corriente por 5 minutos.
- Baño en eosina, sumergir la lámina porta-objetos y sacarla inmediatamente.
- 3 baños rápidos en alcohol isopropílico al 95 %.
- 1 baño rápido en la solución de xilol/alcohol.
- 2 baños rápidos en xilol.

Coloración Hematoxilina-Eosina
Resultados:
Núcleos y material basófilo en tonos de morado.
Citoplasma en tonos de rosado

Glándula salival Sublingual, objetivo 40X

Montaje

Cuando se extrae el porta-objetos del último baño con xilol (baño de aclaramiento), se coloca una gota de bálsamo de Canadá, de Martex® o de Merckoglass®, sobre un extremo del corte y se deja caer suavemente la laminilla cubre-objetos, limpiando luego cualquier exceso, al endurecer el medio de montaje, la lámina porta-objetos protegida con la laminilla cubre-objetos, se puede observar al microscopio.

Histoquímica
Ácido Periódico de Schiff (PAS)

Es de amplia aplicación en el diagnóstico histopatológico rutinario. Puede colorear compuestos como los hidratos de carbono o sustancias relacionadas con ellos.

Compuestos PAS positivos:
- Polisacáridos simples
- Mucopolisacáridos neutros
- Mucoproteínas
- Glucoproteínas del suero, membrana basal y fibras reticulares
- Glucolípidos
- Pigmentos ceroides y ciertas lipofuscinas

Coloraciones de contraste:
- Hematoxilina
- Amarillo de Mars
- Azul de Toluidina
- Picrocarmin de índigo
- Verde de metilo

Ácido Periódico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Núcleos: azul
-Células caliciformes y Chapa estriada en fucsia

Intestino delgado, objetivo 40X

Tricrómicos

Las coloraciones tricrómicas, son tinciones especiales que permiten visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseñados para dar resistencia; en menor intensidadse tiñen las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar los núcleos, citoplasma y las fibras de colágeno.

Tipos de métodos tricrómicos:
- Mallory
- Masson
- Van Gieson
- Gomori

Tricrómico de Van Gieson.
Resultados:
Células:
- Núcleos: negro - azul
- Citoplasma: amarillo

Colágeno: rojo intenso

Piel humana, objetivo 40X

Impregnación Argéntica

Para un estudio citoarquitectónico del tejido nervioso apropiado es necesario aplicar los métodos de impregnación con metales pesados. Con este método es posible observar las células nerviosas aisladas o en grupos (poblaciones), impregnadas en tonos oscuros sobre un fondo homogéneo y claro, apreciándose no tan solo el soma, sino también sus procesos o ramificaciones.

Los métodos originales fueron ideados por Camilo Golgi. En nuestro laboratoio se realizan variantes del mismo y entre las más rápidas y económicas que se han divulgado se incluyen las variantes del método de Golgi-cromato acidificado, específicamente las ideadas por E. Palacios Prü (1976).

Esta técnica es conocida como el método de “la reacción negra”, que conduce al término de impregnación y no de coloración. Como se emplean metales pesados, (ejmplo la plata), se forma un precipitado de microcristales en toda la superficie celular.

Impregnación Argéntica
Resultados:
Célula (neurona):
-Soma y prolongaciones (dendritas, axón) de color pardo oscuro

Corteza cerebral de rata, objetivo 40X

Impregnación Argéntica
Resultados:
Células (neuronas):
-Somas: tonos de marrón
-Prolongaciones (neuropilo) de color pardo oscuro - negro

Médula espinal de rata, objetivo 40X