Partes del Microscopio Fotónico

 

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Normas para el uso correcto del Microscopio Fotónico:

Cada vez que use el microscopio, debe realizar los pasos siguientes:

1. Enchufe el microscopio

2. Coloque el objetivo de menor aumento en el sitio exacto del revólver. Proporciona un aumento de  2.5X

3. Suba el condensador

4. Coloque la lámpara en posición correcta y enciéndala

5. Abra el diafragma

6. Coloque la lámina sobre la platina, con el cubre-objeto hacia arriba

7. Enfoque la lámina moviendo lentamente el tornillo macrométrico

8. Recorra el campo y observe el preparado

9. Cambie y coloque el objetivo de 10X

10. Enfoque la lámina moviendo lentamente el tornillo macrométrico

11. Recorra el campo y observe el preparado

12. Coloque el objetivo de 40X

13. Enfoque la lámina moviendo lentamente el tornillo micrométrico

14. Recorra el campo y observe el preparado, mueva constantemente el tornillo micrométrico

15. Al finalizar la observación, coloque nuevamente el objetivo de menor aumento

16. Retire la lámina del microscopio

17. Apague la lámpara

18. Cubra el microscopio con la funda protectora de plástico

 

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Coloración Hematoxilina-Eosina
Protocolo. Preparación de los colorantes

Hematoxilina
La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae de la corteza del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, para ser empleada como tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína.
Tras el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter fuertemente básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada o negruzca, dependiendo de la sal metálica utilizada.
La laca de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico, conocida también en forma genérica como hemalumbre.

Reactivos:
Alumbre de Amonio o de Potasio (mordiente) 50 g
Cristales de hematoxilina 1 g
Yodato de Sodio 0,2 g
Ácido cítrico 1 g
Hidrato de cloral (bactericida) 50 g
Agua destilada 1000 mL

Procedimiento:
- Calentar la mitad del volumen de agua destilada a una temperatura por debajo del punto de ebullición.
- Pesar el alumbre de amonio o de potasio y agregarlo al agua que se está calentando hasta que se disuelva.
- Pesar los cristales de hematoxilina y agregarlos hasta que se disuelvan (aproximadamente en 20 minutos).
- Agregar el resto del agua destilada.
- Pesar y agregar el ácido cítrico, dejar reposar por 10 minutos.
- Pesar y agregar el yodato de sodio, dejar reposar por 10 minutos.
- Pesar y agregar el hidrato de cloral, dejar reposar por 10 minutos.
- Envasar en frasco ámbar y almacenar en la oscuridad. Mientras más tiempo permanezca en depósito, el proceso de maduración del colorante será mejor y se obtendrán mejores resultados.

Eosina
La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que contienen (eosina Y: cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo).
En general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en las estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares.

Para la preparación de la eosina (solución madre), el procedimiento es el siguiente:
Solución “A”
Reactivos Cantidad
Eosina amarillenta (Y) 3 g
Alcohol etílico o isopropílico 300 mL
Agua destilada 200 mL

Solución “B”
Reactivo Cantidad
Biebrich escarlata 1 g
Agua destilada 100 mL

Procedimiento:
- Preparar las 2 soluciones por separado. Las dos soluciones constituyen la solución madre.
- Tomar 1 parte de la solución madre y 3 partes de alcohol al 70 %.
- Agregar 3 –6 gotas de ácido acético.

Método de la Hematoxilina-Eosina
Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina (generalmente se emplea la de Harris, aunque también se emplean la de Mayer y la de Ehrlich). Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina, y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina.

Procedimiento Técnico:
Soluciones:
- Xilol
- Alcohol isopropílico al 95 %
- Agua corriente
- Hematoxilina
- Eosina
- Xilol/Alcohol

Protocolo:
- Después del desparafinaje, 3 baños en alcohol isopropílico al 95 % (3 recipientes distintos), el último baño debe ser el más prolongado (5 minutos).
- Baño en agua corriente durante 2-3 minutos, agitar suavemente.
- Baño en hematoxilina por 5 minutos
- Baño en agua corriente por 5 minutos.
- Baño en eosina, sumergir la lámina porta-objetos y sacarla inmediatamente.
- 3 baños rápidos en alcohol isopropílico al 95 %.
- 1 baño rápido en la solución de xilol/alcohol.
- 2 baños rápidos en xilol.

Coloración Hematoxilina-Eosina Resultados: Núcleos y material basófilo en tonos de morado. Citoplasma en tonos de rosado Esófago, objetivo 40X