CAPÍTULO 6
TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

6.1.-Microscopio de campo oscuro

De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una linterna un cuarto oscuro y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque reflejan o difractan la luz, los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).

La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida (trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose una interesante imagen con relieve (15, 96) (fig. 6-2).

El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico que además mejora la resolución (12, 15) (fig. 6-3). Con este dispositivo se forma un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro (21) (figs. 6-4 y 6-5).

Figura 6-2.-Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un disco negro de mayor diámetro. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

 

Figura 6-3.-Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

 

Figura 6-4.-Células epiteliales observadas en microscopio de campo oscuro. Modificada de Wegerhoff, R., Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image (12).

 

Figura 6-5.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupción. En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

 

 

6.1.1.-Iluminación Rheinberg

Inventada alrededor de 1895 por un microscopista inglés llamado Julius Rheinberg. Se basa en la iluminación de campo oscuro (15) y se emplea con objetivos de bajo y mediano aumento. Es una forma de coloración óptica que emplea filtros de colores para iluminar tanto el espécimen como el fondo oscuro, obteniéndose imágenes con efectos muy atractivos y espectaculares, pero con la definición y datos de la iluminación de campo oscuro. Se utiliza un filtro central rodeado de otros filtros en uno o varios colores que contrastan con él. El diámetro de la máscara central dependerá del objetivo y debe ser del mismo tamaño que para campo oscuro. La iluminación Rheinberg combina la iluminación convencional de campo claro en un color con la iluminación de campo oscuro en otro color (figs. 6-6, 6-7 y 6-8).

 

 

Figura 6-6.-Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores permanentes para transparencias. Un filtro de color verde en la periferia incrementa los detalles porque el ojo humano visualiza muy bien ese color. Es importante que el filtro central sea más oscuro que el filtro periférico. Se pueden emplear los colores que se deseen. Tomado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

 

 

Figura 6-7.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran el aspecto obtenido con la iluminación Rheinberg. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

 

 

Figura 6-8.-Microfotografía de un nematodo iluminado con la técnica de Rheinberg. El parásito aparece de color azul claro sobre un fondo violáceo. Tomado de Santamaría Nino (2007) Microfotografías (97).

 

6.1.2.-Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

Aplicaciones del microscopio de campo oscuro (15, 96, 97):
• Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran).

• Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.

• Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.

 

 

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6.2.-Microscopio de contraste de fase

6.3.-Microscopio de luz polarizada

6.4.-Microscopio de contraste por interferencia diferencial

6.5.-Microscopio de fluorescencia

6.6.-Microscopio de luz ultravioleta

6.7.-Microscopio confocal

6.8.-Otros tipos de microscopios