Capítulo 1:
Limitaciones para el estudio de células y tejidos
Capítulo 2:
Nociones básicas de óptica
Capítulo 3:
La imagen. Sistemas ópticos
Capítulo 4:
El microscopio compuesto
Capítulo 5:
El microscopio electrónico
Capítulo
6:
Técnicas especiales de microscopía
LA MICROSCOPÍA:
HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS
CAPÍTULO
6
TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA
6.1.-Microscopio de campo oscuro
6.2.-Microscopio de contraste de fase
6.3.-Microscopio de luz polarizada
Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. También se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso inicial en el estudio de minerales, sin embargo su aplicación se ha extendido al campo de la biología, medicina, química y muchas otras disciplinas. Esta técnica microscópica puede emplear tanto la luz transmitida como la luz incidente (trans-iluminación y epi-iluminación respectivamente).
Comparada
con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de
la luz polarizada es la más efectiva en el estudio de muestras
ricas en materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable
la calidad de la imagen.
La luz proveniente de una fuente estándar de iluminación
vibra y se propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro
polarizador las ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un
mismo plano. El polarizador es un dispositivo que solo deja pasar la
luz que vibra en un plano determinado denominado eje de polarización
(13) (fig. 6-14).
Figura 6-14.-Esquema que muestra el efecto de filtros polarizadores en un rayo de luz. A la izquierda la luz no polarizada se distribuye en todos los planos, pero al pasar por el primer filtro (horizontal) éste sólo deja pasar las ondas que se propagan en un plano horizontal. Si se interpone un filtro polarizador orientado de manera vertical (rotado 90º en relación al horizontal) la luz polarizada no pasa y se detiene. Tomada de Multimedia Encarta Luz Polarizada (28).
Muchos materiales tienen sus átomos uniformemente distribuidos en las tres direcciones principales del espacio y presentan una máxima simetría (cúbica o regular) o por el contrario, en algunos materiales sus átomos carecen de organización. Los primeros tienen las mismas propiedades ópticas, independientemente de la dirección en que se midan. Cuando la luz atraviesa sustancias con estas características, la velocidad es la misma en todas las direcciones y gracias a ello se denominan isótropos. Por el contrario, los materiales cuya organización cristalina es diferente (hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico, entre otras) poseen sus constituyentes dispuestos de manera asimétrica y varían según la dirección; en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas también en diferente, denominándose anisótropos (101). La estructura interna del espécimen determina su comportamiento isótropo o anisótropo.
Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espécimen,
los materiales anisótropos presentan distintos índices
de refracción en relación a la dirección del haz
de luz; por el contrario, los materiales isótropos presentan
un índice de refracción constante. Cuando un rayo de luz
incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente
se presenta el fenómeno de la doble refracción o birrefringencia;
esto quiere decir que se producen dos rayos refractados distintos que
vibran en planos diferentes que se propagan con diferentes velocidades
en el interior del material.
Este microscopio facilita la investigación de las propiedades
ópticas de los especímenes y es ideal para observar y
fotografiar aquellos elementos que son visibles gracias a la anisotropía,
de allí su uso en cristalografía; sin embargo, también
se emplea para estudiar el carácter birrefringente de muchas
estructuras celulares anisótropas.
El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción
de la luz polarizada con los elementos birrefringentes del espécimen
que producen las dos ondas refractadas, cada una de ellas polarizada
en planos perpendiculares. Una vez que las ondas de luz salen del espécimen
lo hacen de manera desfasada (ver fig. 6-9) pero son recombinadas al
pasar por otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio
de luz polarizada permite el estudio comparativo entre minerales tomando
en cuenta la absorción del color e índices de refracción.
Sin embargo, en biología su principal utilidad consiste en distinguir
las sustancias isotrópicas de las anisotrópicas, revelando
información detallada sobre la estructura y composición
de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines diagnósticos
(102). El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra la luz
y la luz polarizada puede ser detectada como un incremento en la intensidad
luminosa o como un efecto de color. O en lo cotidiano, por ejemplo,
con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el resplandor
de la luz ambiental.
El 90% de las sustancias sólidas son anisotrópicas y como materiales isotrópicos se pueden enumerar una variedad de gases, líquidos y cristales.
Este
microscopio está equipado con:
• Polarizadores: Un primer filtro polarizador colocado entre la
fuente de luz y el condensador que se puede rotar 360º y un analizador
o segundo polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su lente
posterior y el tubo de observación o cámara fotográfica.
También puede rotarse 90º o 360º. Los polarizadores
antiguos conocido como nicoles estaban conformados por un sistema de
prismas de calcita descrito por W. Nicol y. En los microscopios actuales
el polarizador está constituido por una lámina polaroid,
que consiste en una película de un polímero transparente
(revestida de cristales minúsculos de sulfato de iodoquinina
orientados en la misma dirección) interpuesta entre dos placas
de vidrio (102) (fig. 6-15).
• Condensador polarizador: Debe estar libre de desperfectos en sus componentes ópticos.
• Platina circular: Con capacidad de rotar 360º para facilitar la orientación del eje óptico con el campo de visión. Puede contener un vernier para medir los ángulos de rotación. El espécimen debe rotarse y colocarse en una posición diagonal en la cual los elementos anisotrópicos se observarán más brillantes (birrefringentes).
• Objetivos polarizadores: Diferentes a los objetivos comunes, estos deben estar libres de desperfectos y tener capacidad polarizadora. Son ensamblados de manera que se evita en lo posible el daño de las lentes ya que cualesquier daño por mínimo que sea compromete el rendimiento del objetivo. Poseen la inscripción P, PO, o Pol.
• Ocular con una cruz visible en el campo visual: Para marcar el centro del campo visual.
•
Lente de Bertrand: Situada inmediatamente debajo del ocular, es removible
y sirve para ver la interferencia con la finalidad de ajustar la iluminación
de una manera precisa.
Figura 6-15.-Esquema simplificando la técnica de iluminación con luz polarizada. El filtro polarizador (1) está localizado por debajo del condensador (2) y el espécimen (3) es iluminado con luz polarizada lineal. El analizador (5) rotado en ángulo de 90º en relación a (1) está localizado detrás del objetivo (4). Una lente (6) en el tubo forma la imagen intermedia (7). Tomada de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).
Si no hay espécimen en la platina el campo se observará completamente oscuro. Al colocar un portaobjeto con alguna muestra, los elementos anisótropos cambian la dirección de la vibración de la luz polarizada y el contraste se evidencia en la imagen con algunos colores cuando se emplea otro dispositivo denominado plato lambda (figs. 6-16, 6-17 y 6-18).
Figura 6-16.-Micrografía de cartílago hialino visto con luz polarizada en donde se aprecia la birrefringencia del colágeno que forma parte del pericondrio, correspondiendo a las estructuras rosadas brillantes. Tomado de Laboratorio de Investigaciones Histológicas Aplicadas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina (103).
Figura 6-17.-En un paciente con amiloidosis sistémica se realizó un estudio comparativo de dos micrografías de un glomérulo renal. A la izquierda con tinción de rojo Congo los depósitos son de color rojizo o naranja intenso y a la derecha la muestra es visualizada al microscopio de luz polarizada que permite apreciar la verdadera positividad con la birrefringencia de color amarillo. 600x. Tomado de Arias L. Nefropatología (104).
Figura 6-18. Micrografía de luz polarizada de fibrocélulas musculares estriadas en la cual se aprecia el patrón de bandas y estriaciones transversales. Tomado de Junqueira y Carneiro (2005) (105).
6.3.1.-Aplicaciones del microscopio de luz polarizada
• Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares (como el citoesqueleto) y extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen exógeno).
•
Identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales.
6.4.-Microscopio de contraste por interferencia diferencial
6.5.-Microscopio de fluorescencia
6.6.-Microscopio de luz ultravioleta
6.7.-Microscopio confocal
6.8.-Otros tipos de microscopios