CAPÍTULO 3
LA IMAGEN. SISTEMAS ÓPTICOS.

3.1.-La imagen. Consideraciones

3.2.-Sistemas ópticos

---

 

3.3.-Fundamento de la microscopía:

Sobre la base de las consideraciones anteriores se ha definido la microscopía como la técnica que permite observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) y obtener una imagen aumentada del mismo y para ello es necesario tener en cuenta estos tres elementos:
• El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo).
• Una fuente de iluminación.
• Un sistema óptico.

Cuando se plantea el estudio de alguna célula, tejido u órgano, previamente se debe definir cuales aspectos (morfológicos, bioquímicos, fisiológicos, genéticos, entre otros) se desean analizar, o si se desea observar células vivas o células fijadas. En base a esto último se definirá y planificará la metodología a seguir. Se seleccionará la técnica de visualización y el tipo de instrumento óptico para obtener las imágenes. Las técnicas de laboratorio para preparar la muestra y obtener el preparado histológico que será observado, dependerán en gran medida del tipo de microscopio requerido para visualizarlo, según los aspectos que han sido definidos previamente.

De la misma manera que se ha razonado en relación al preparado histológico (objeto), se debe analizar el papel que juega la luz o sistema de iluminación empleado. Se desea evidenciar y distinguir a mayor aumento los detalles del objeto que se estudia. Generalmente se habla de la iluminación, término ampliamente utilizado, que en microscopía no siempre denota el empleo de un rayo luminoso conformado por fotones, los cuales si pueden ser captados por la retina del ojo.

Además de la luz solar y la luz producida por bombillas incandescentes, también se pueden emplear otros tipos de radiaciones electromagnéticas, tales como la luz ultravioleta, los rayos láser o un haz de electrones. Estos últimos no son captados por la retina pero si por una placa fotográfica o una pantalla fluorescente, siendo considerados como un tipo de “iluminación”, que a pesar de no estar constituida por fotones, también permite la formación de una imagen que muestra los detalles finos de un espécimen.

Para iluminar el objeto se pueden emplear dos mecanismos, ya sea que el rayo de luz lo atraviese o que simplemente incida en cierto ángulo sobre el objeto. En el primer caso se habla de trans-iluminación y en el segundo caso de epi-iluminación.

3.3.1.-Trans-iluminación:
La trans-iluminación ha sido indudablemente el primer método de iluminación en la larga historia de la microscopía. El rayo electromagnético (luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto, en éste caso un corte histológico (fig. 3-2). Como condiciones fundamentales para ser observados al microscopio compuesto, los preparados biológicos deben ser muy delgados y transparentes. Deben ser rebanados con instrumentos especializados (micrótomos) que permiten obtener cortes cuyo espesor debe estar en el orden de las micras. Rutinariamente el espesor del corte puede oscilar en un rango que va de 1 a 5µm, pero su grosor dependerá del tipo de células y tejidos. Para el estudio de las neuronas se realizan cortes más gruesos (alrededor de 30 µm), mientras que para el estudio de células del riñón, en ciertos casos son ideales los cortes de 4 µm. Para la microscopía electrónica se emplean cortes cuyo espesor está en el orden de los nanómetros (cortes ultra finos) debido al bajo poder de penetración de los electrones.

La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado histológico). Las células son incoloras por naturaleza, pero algunas poseen color propio (pigmentos). Para mejorar la transparencia se emplean ciertas sustancias químicas (agente aclarador) como el xilol, entre otros. Ser transparente facilita en gran medida el paso del rayo de luz. La estructura de las células y tejidos es muy heterogénea y crea diferentes densidades en los compartimientos intra y extracelulares. Para mejorar la visualización de tales variaciones en la concentración de los constituyentes celulares, se pueden emplear colorantes u otros reactivos químicos que incrementen el contraste entre ellas y permitan su identificación. Esto no siempre es necesario, puesto es factible sin ningún tipo de colorantes observar células con algunos microscopios especiales, cuyo sistema de iluminación crea contrastes muy evidentes, que de ordinario no se observan con el microscopio compuesto clásico.

La trans-iluminación permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz importante, resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. El microscopio compuesto clásico emplea este tipo de iluminación y por ello también se denomina de campo claro. La microscopía electrónica de transmisión (14) y la mayoría de microscopios especiales también se fundamentan en este principio.

 

3.3.2.-Epi-iluminación:
Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra (fig. 3-2). La iluminación puede abarcar simultáneamente todo el campo de visión o por el contrario, focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible obtener imágenes tridimensionales, complementando de esta manera lo observado con la microscopía por trans-iluminación. Varios tipos de microscopios emplean este método y como ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscópicos para microdisecciones, y los microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrónico de barrido.

 

Figura 3-2.-Comparación de los mecanismos de iluminación más empleados en microscopía. La flecha amarilla representa el haz de luz incidente sobre la muestra, que en la transiluminación atraviesa la misma; mientras que en la epi-iluminación el rayo incide de manera oblicua y en este caso son los rayos reflejados los que se capturan para formar la imagen.

---

3.4.-Aumento y resolución

3.4.1.-Aumento

3.4.2.-Resolución

3.4.3.-Factores que determinan el poder de resolución

3.5.-Factores que limitan la resolución en un sistema de formación de imágenes

3.5.1.-Difracción

3.5.2.-Aberraciones

3.5.3.-Corrección de las aberraciones de los objetivos