CAPÍTULO 6
TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

Una de las finalidades de la microscopía es permitir observar los especímenes de la mejor manera posible, logrando un buen balance entre el contraste y la resolución. Esto es de extrema utilidad en muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural son transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen invisibles a pesar de la resolución. Esto se debe a que las células incoloras absorben muy poca luz y por lo tanto en un microscopio de campo claro no se ven correctamente. Hay células (eritrocitos por ejemplo) que poseen pigmentos propios que le confieren color y contraste suficientes, pero esto es la excepción.

Desafortunadamente, con los microscopios compuestos de campo claro ordinarios, no se puede lograr un buen contraste de células vivas no coloreadas. Los microscopios de campo claro se denominan así debido a que las muestras son observadas en un campo brillante muy iluminado, en el cual, el contraste se sacrifica a expensas de la resolución y viceversa, limitándose por ejemplo el estudio de células y tejidos vivos, en los cuales la adición de sustancias químicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones en la estructura de la célula e incluso producirle la muerte.

El interés de observar células vivas radica en la posibilidad de captar procesos vitales en pleno desarrollo, tales como la motilidad, la división, la fagocitosis y muchos otros. Estas particularidades han motivado a los investigadores a buscar métodos para incrementar el contraste con la finalidad de obtener imágenes de células vivas con más detalles. De ordinario, en el microscopio convencional, esto se puede lograr de cierta manera si se reduce la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz; con estas maniobras se incrementa el contraste, pero lamentablemente también se reduce seriamente la resolución y la nitidez.

Durante años los investigadores han buscado los procedimientos para resolver estas limitaciones al estudiar tanto células incoloras como células teñidas, llegando a aplicar métodos sencillos que logran incrementar el contraste sin afectar tanto la resolución. Por ejemplo, cuando la finalidad es tomar micrografías en blanco y negro, aplicando las técnicas de fotografía convencional se aumenta el contraste empleando filtros de colores y esto ha sido de gran utilidad. En especímenes coloreados de rojo, el empleo de un filtro verde oscurece las áreas rojas e incrementa el contraste, pero aclara las áreas teñidas con colorantes verdes (15).

Más recientemente, con el empleo de programas informáticos de digitalización y edición de imágenes, las micrografías de células incoloras pueden ser tratadas mejorando de manera significativa el contraste (fig. 6-1), sin embargo, para observar más detalles en los especímenes vivos necesariamente hay que emplear otros métodos ópticos de contraste más sofisticados (12).

Figura 6-1.- Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa bucal antes (izquierda) y después (derecha) de modificación digital para mejorar el contraste. Modificada de Wegerhoff R, Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image. (12).

 

En este sentido, las limitaciones presentadas por los microscopios compuestos ordinarios han sido superadas mediante el diseño y fabricación de microscopios particulares o de accesorios especiales, notablemente en lo que a sistema de iluminación se refiere; ya sea empleando otro tipo de fuente luminosa o utilizando filtros para modificar la energía lumínica empleada y modificando la conformación de los condensadores. Estas modificaciones han permitido la creación de diversos microscopios cuyas funciones amplían las posibilidades del microscopio compuesto estándar, lo que permite obtener otros datos más allá de los límites de la microscopía fotónica convencional.


Se han diseñado técnicas microscópicas más complejas que incrementan el contraste sin afectar la resolución. Son artificios que proporcionan efectos ópticos en la muestra, permitiendo que aquellos detalles que pasan desapercibidos se traduzcan en cambios de intensidades luminosas las cuales si pueden ser reconocidas por el ojo humano. Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

• La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de condensadores y filtros:
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de contraste de fase.
- Microscopio de luz polarizada, Microscopio petrográfico y metalúrgico.
- Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski.

• La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz ultravioleta o rayos láser:
- Microscopio de luz ultravioleta.
- Microscopio de fluorescencia.
- Microscopio confocal.

 

Estos microscopios concebidos más recientemente han dado origen a un renacimiento de la microscopía.

6.1.-Microscopio de campo oscuro

6.1.1.-Iluminación Rheinberg

6.1.2.-Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

 

6.2.-Microscopio de contraste de fase

6.2.1.-Aplicaciones del microscopio de contraste de fases

 

6.3.-Microscopio de luz polarizada

6.3.1.-Aplicaciones del microscopio de luz polarizada

 

6.4.-Microscopio de contraste por interferencia diferencial

6.4.1.-Aplicaciones del microscopio de contraste por interferencia diferencial

 

6.5.-Microscopio de fluorescencia

6.5.1.-Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

6.5.2.-Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

 

6.6.-Microscopio de luz ultravioleta

6.6.1.-Aplicaciones del microscopio de luz ultravioleta

 

6.7.-Microscopio confocal

6.7.1.-Ventajas del microscopio confocal

6.7.2.-Principio de la microscopía confocal

6.7.3.-Configuración del microscopio confocal

6.7.4.-Cortes ópticos y reconstrucción 3D

6.7.5.-Aplicaciones del microscopio confocal

 

6.8.-Otros tipos de microscopios

6.8.1.-Microscopios de barrido con sondas

6.8.2.-Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones

6.8.3.-Microscopio acústico

 

 

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