Inicio

Introducción

Capítulo 1:
Limitaciones para el estudio de células y tejidos

Capítulo 2:
Nociones básicas de óptica

Capítulo 3:
La imagen. Sistemas ópticos

Capítulo 4:
El microscopio compuesto

Capítulo 5:
El microscopio electrónico

 Capítulo 6:
Técnicas especiales de microscopía

Capítulo 7:
Nuevas tendencias

Conclusiones

Bibliografía

Anexos

 

 


  

 

LA MICROSCOPÍA:

HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS


CAPÍTULO 5
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.

5.1.-Nociones elementales

5.2.-Técnicas de microscopía electrónica

5.2.1.-Diseño del microscopio electrónico de transmisión

5.2.2.-Diseño del microscopio electrónico de barrido

5.3.- Formación de la imagen en los microscopios electrónicos

5.4.-Poder de resolución: Aumentos



5.5.-Preparación de los especímenes. Contraste. Aplicaciones

5.5.1.-Microscopía electrónica de transmisión

La resolución que se puede lograr con el microscopio electrónico depende del espesor del corte del tejido y de factores que determinen el contraste. Si el corte es grueso se enmascaran los detalles finos, los cuales se hacen cada vez más imperceptibles y oscuros debido a la superposición de elementos que se presentan en los diversos planos de profundidad. De allí que es imperativo el empleo de cortes ultrafinos.

De manera resumida, los pasos necesarios en el procesamiento del tejido antes de ser observado al microscopio electrónico de transmisión son los siguientes (14, 21, 23):

1. Fijación: El tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraóxido de osmio (OsO4) y glutaraldehído, con un cuidadoso manejo del pH (con cacodilato de sodio), para mantener las membranas y las proteínas celulares en una malla tridimensional resistente. Los aldehídos crean puentes cruzados entre sí y enlaces covalentes con los grupos amino que estén libres en las proteínas. De esta manera se previene la degradación oxidativa por la muerte del espécimen.

2. Contraste: Las organelas y estructuras de interés deben ser electrón-densas y contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con el número atómico de los elementos y solo átomos pesados crean contraste. Se contrasta con tetraóxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.

3. Deshidratación: El espécimen va a estar en el vacío y no puede contener agua, pues esta se evaporará y dispersará los electrones. El agua se elimina mediante alcoholes en grado creciente de concentración.

4. Inclusión: El espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y resinas epóxicas o acrílicas, las cuales se endurecen y forman un bloque sólido de plástico muy duro.

5. Corte: Se emplea un ultramicrótomo que permite rebanar el tejido en cortes ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm. Los electrones tiene un bajo poder de penetración y no es conveniente usar cortes gruesos.

6. Observación y toma de micrografías.

 

Algunas aplicaciones del Microscopio electrónico de transmisión:

• Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos (91,92, 93).

• Realización de estudios de histoquímica e inmunohistoquímica para identificar compuestos específicos.

• Reconocimiento de virus y sus características ultraestructurales.

• Estudios de citoquímica.

• Estudios de estructuras moleculares.

• Determinación de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.

• Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.

• Determinación del tamaño de partículas.

• Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

 

5.5.2.-Microscopía electrónica de barrido

La preparación de los especímenes difiere un poco de la preparación para el microscopio electrónico de transmisión, pues el microscopio electrónico de barrido muestra imágenes en tres dimensiones (3D) en aumentos de hasta 20.000x y una resolución que puede llegar a los 5nm.


Preparación de la muestra (21, 23):
1. Fijación: Según métodos estándar de fijación.

2. Deshidratación: Mediante varios métodos, pero uno de los más utilizados es el de deshidratación por punto crítico en CO2, en el cual el agua pasa rápidamente de estado líquido a vapor sin ebullición. La deshidratación por alcohol produce artificios en el espécimen y no es utilizada.

3. Corte: Algunos especímenes no ameritan ser rebanados, pues se observará la superficie del mismo.

4. Contraste: El espécimen deshidratado es revestido por una capa de grafito o de oro.

5. Observación y toma de microfotografías.

 

Algunas aplicaciones del Microscopio electrónico de barrido:

• Morfología de células y tejidos animales, humanos o vegetales (91).

• Morfología interna de células y tejidos.

• Morfología superficial de minerales.

• Formas de cristalización de minerales.

• Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.

• Estudio de moléculas.

• Reconocimiento de fósiles.


5.6.-Microfotografía electrónica: Interpretación de las imágenes

5.7.-Semejanzas y diferencias entre la microscopía electrónica y la microscopia de luz