Capítulo 1:
Limitaciones para el estudio de células y tejidos
Capítulo 2:
Nociones básicas de óptica
Capítulo 3:
La imagen. Sistemas ópticos
Capítulo 4:
El microscopio compuesto
Capítulo 5:
El microscopio electrónico
Capítulo
6:
Técnicas especiales de microscopía
LA MICROSCOPÍA:
HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS
CAPÍTULO
4
EL MICROSCOPIO COMPUESTO.
4.2.-Partes del microscopio compuesto moderno
4.3.-Sistema mecánico del microscopio
4.4.-Sistema óptico del microscopio
4.5.-Sistema de iluminación
El sistema de iluminación está constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observación microscópica. Uno de los aspectos críticos a considerar en la microscopía óptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espécimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se verá afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema óptico. La iluminación óptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observación.
Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine fotónico. En sus inicios, la microscopía se practicaba con iluminación por reflexión; se utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lámparas de aceite o petróleo) y la desviaba hacia la preparación. Este método se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vacío y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbón, tungsteno, entre otros) que al paso de una corriente eléctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50).
Con el uso de la bombilla eléctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales, desde los más sencillos y económicos hasta los más sofisticados, aún poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso que ésta no se encuentre alineada con la platina.
El sistema
de iluminación está constituido por la fuente de luz,
el condensador y un diafragma o iris. Como regla general, el sistema
de iluminación está colocado debajo de la platina y la
finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayoría
de los casos el estudio de las preparaciones histológicas se
hace por transiluminación. En otros casos muy específicos
se emplea el método de luz reflejada, en el cual se ilumina la
superficie del espécimen mediante epi-iluminación (ver
capítulo 3). La fuente de luz emite una radiación que
es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez
forma un cono luminoso necesario para la visualización con objetivos
de mayor aumento.
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen numerosas fuentes de iluminación artificial, tanto para la observación rutinaria como para la microfotografía. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la intensidad; además es muy favorable para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:
• Bombillas de tungsteno y halógenas: La mayoría de microscopios de luz están dotados de lámparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lámparas son radiadores térmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300 – 1200 nm. Están constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado por una corriente eléctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varían mucho en tamaño, diseño y forma (68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observación y se reduce con filtros que disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los colores. También se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del espécimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definición.
• Lámparas de arco eléctrico: Son lámparas que pueden contener gases (vapor de mercurio, xenón o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromática con filtros apropiados, ideal para microfotografía en blanco y negro o a colores. También se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia).
• Láser: En los últimos años se ha incrementado el uso de láser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificación de Luz por Emisión Estimulada de Radiación) (42), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con características de tamaño, coherencia, forma y pureza controladas. El láser de argón es uno de los más utilizados, cuya emisión está en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en microscopía confocal.
•
LED: De las siglas en inglés Light-Emitting Diode (diodo emisor
de luz) es un dispositivo emisor de luz con características muy
próximas a la luz monocromática (espectro reducido). La
luz se produce cuando una corriente eléctrica pasa a través
del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que están
hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lámparas.
En comparación con las bombillas incandescentes, son más
interesantes porque permiten ahorro de energía con un mayor rendimiento
lumínico. Para microscopía se emplean LED de larga duración
que proveen una luz muy brillante y fría; esto último
es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observación
es más cómoda para el usuario. En la actualidad se producen
combinaciones de diodos que emiten una luz blanca.
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El término condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen más clara.
El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen. El primer condensador que se fabricó en 1838 (por Dujardin) poseía tres lentes acromáticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y también producen aberraciones, sin embargo, éstas también pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones
ópticas (15):
• Condensador de Abbe: Es el más simple,
sin corrección de aberraciones y el más económico.
Compuesto de dos o más lentes. Puede llegar a tener una apertura
numérica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observación
de rutina y con objetivos de modesta apertura numérica y amplificación.
Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede
producir.
• Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad.
•Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografía (blanco y negro o color).
•Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es óptimo con inmersión y objetivos de mayor aumento.
El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada
para optimizar la intensidad y el ángulo de apertura. Cada vez
que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el
cono de luz conveniente a la apertura numérica del nuevo objetivo.
A menudo no es práctico utilizar el mismo condensador para un
amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos de bajo poder
de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una lente frontal
adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante
un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercándolo
o no a la platina donde está colocado el espécimen (fig.
4-10).
Además
de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro, existe
una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan
en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento
del contraste entre los detalles de la estructura del espécimen.
Se han desarrollado condensadores especiales para microscopía
de campo oscuro, contraste de fase, luz polarizada, contraste de interferencia
diferencial.
Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotónico. El medio de inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistían en un disco de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual se rotaba según la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo más elaborado y con un diseño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11).
Figura 4-11.-Iris con mecanismo para variar la apertura. Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (70).
La iluminación es una variable crítica que hay que considerar al poner en funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminación, aún en equipos sofisticados, conduce a la obtención de imágenes defectuosas. El espécimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se observa.
En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un método de iluminación para optimizar la observación microscópica y la microfotografía (15), que permite aprovechar al máximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo diámetro sea igual al del área de captura del objetivo. Los microscopios modernos están diseñados para aplicar la iluminación Köhler y los requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13):
• Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
• Bombilla con lente colectora.
•
Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara
y un diafragma de apertura, colocado debajo del condensador.
Figura 4-12.-Iluminación Köhler. Se debe iluminar el espécimen siguiendo el esquema. La lámpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S’ del filamento de la lámpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su punto focal esté en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparación por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (72).
El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen nítida del diafragma de campo. La iluminación ideal se consigue cuándo el condensador se encuentra lo más cerca de la preparación. El diafragma de campo regula el diámetro de la apertura de la iluminación y al cerrarlo se incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la iluminación Köhler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lámpara mediante un ajuste de voltaje.
Figura 4-13.-Trayectoria de la luz en la iluminación Köhler. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).
4.6.-Formación de la imagen en el microscopio compuesto
4.7.-Accesorios del microscopio