Microscopía

CAPÍTULO 4
EL MICROSCOPIO COMPUESTO.

4.2.-Partes del microscopio compuesto moderno

4.3.-Sistema mecánico del microscopio

4.4.-Sistema óptico del microscopio

Los microscopios modernos están diseñados para proporcionar imágenes aumentadas y nítidas de los especímenes que se observan. Los componentes ópticos están colocados en una base estable que permite un intercambio rápido y un alineamiento preciso. El sistema óptico está constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.

4.4.1.-Los objetivos

Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal función consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.

Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje óptico del sistema. Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolución y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.

Clasificación:
Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión (64, 65, 66):

• Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromático cuando no posee ninguna denominación.

• Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados para la microfotografía en colores.

• Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan-apocromáticos.

Objetivos secos y objetivos de inmersión:
Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1,515) casi idéntico al del vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.

Óptica finita y óptica infinita:
La microscopia de luz o fotónica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas ópticos en los últimos años. El tubo que soporta tanto el revólver por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilíneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografía. Emplear objetivos diseñados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.

Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes están elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseñados para realizar una corrección infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta corrección poseen el símbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparición de imágenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de mayor tamaño (66) (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con corrección al infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (66).

Estructura de los objetivos:
Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas las especificaciones y características.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).

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Nomenclatura de los objetivos:

La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa información, generalmente en el idioma inglés, puede contener (fig. 4-6):

• Nombre del fabricante: Casa comercial

• Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x

• Correcciones ópticas: Achro, Achromat (acromáticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromáticos); Apo (apocromáticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.

• Apertura numérica: Es un valor que indica el ángulo de apertura del cono luminoso.

• Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160, 170, 220) o con el símbolo (8) para objetivos con corrección infinita.

• Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de corrección en las lentes internas para realizar la corrección y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada móvil para el ajuste.

• Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milímetros.

• Propiedades ópticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados óptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).

• Rosca del objetivo: La mayoría de objetivos están estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El diámetro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca más amplia y sólo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.

• Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersión y para ello se emplea un código de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).

• Código de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificación del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades ópticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Código de color de inmersión	Medio de inmersión
Negro	Aceite
Naranja	Glicerol
Blanco	Agua
Rojo	Especial o multiuso

Código de color de aumento	Aumento
Negro	1x, 2.5x
Marrón	2x, 2.5x
Rojo	4x, 5x
Amarillo	10x
Verde	16x, 20x
Azul turquesa	25x, 32x
Azul celeste	40x, 50x
Azul cobalto	60x, 63x
Blanco, crema	100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos microscópicos. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

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4.4.2.-El ocular

El ocular (del latín oculus = el ojo) está formado por lentes que generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:

• Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen.

• Aplana y aclara el campo óptico o plano circular en el que aparece el objeto.

La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior también se denomina colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).

Clasificación:

• Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromáticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad está dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. También denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy común en modelos de microscopios antiguos (11).
• Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre sí y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera óptima con los objetivos corregidos al infinito (15).
• Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos.
• Oculares de proyección: Posee una lente que permite la proyección de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición (11).
• Oculares aplanéticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo óptico (11).
• Oculares peri-planáticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (11).

Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseños de oculares más avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromáticas, la curvatura de campo y su empleo óptimo es en combinación con objetivos de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitución del ocular Periplan. Es un ocular negativo. Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios más simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos más modernos son trinoculares, especiales para la microfotografía. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinación de 45º para realizar la observación cómodamente.

Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de coprología o hematología, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observación de la preparación, lo cual se dificulta con un campo circular clásico al quedar zonas superpuestas (11).

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en milímetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.

Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus características:
• UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.

• H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observación microscópica.

• K, C, comp: Para oculares compensadores.

• Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificación o medición de estructuras del espécimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el número, tamaño o dimensiones de las células y demás elementos del tejido.

Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del espécimen al encontrarse en el plano de formación de la misma. Los oculares para la medición poseen un mecanismo de enfoque mediante rotación. Se debe calibrar la escala de medición del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algún software de computación para realizar mediciones sobre las imágenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el método más económico y de uso más generalizado es la medición con los oculares.

En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaña, cerda) denominada señalador, con la finalidad de indicar de manera específica alguna estructura en particular en el campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.

Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observación y por otra, impedir la formación de reflejos luminosos que dificulten la visualización. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptrías en caso que el observador posea una disminución de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografía de un frotis de sangre periférica en la que se observa un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamaño de una célula se cuenta el número de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamaño de la misma. Si la célula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7µm. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2ª ed. (13).

4.5.-Sistema de iluminación

4.6.-Formación de la imagen en el microscopio compuesto

4.7.-Accesorios del microscopio

4.8.-Tipos de microscopios