CAPÍTULO 5
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.

5.1.-Nociones elementales

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5.2.-Técnicas de microscopía electrónica

El principio de la microscopía electrónica es muy similar al de la microscopia de luz y se han desarrollado dos principales técnicas (14):

1. Microscopía electrónica de transmisión: Se observa a través del espécimen (trans- iluminación). El espécimen se corta en láminas ultrafinas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado. Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica situada por debajo del mismo. La resolución puede ser de 0,2nm.

2. Microscopía electrónica de barrido: Se observa la superficie de un espécimen sólido (epi-iluminación). Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x. Se producen imágenes muy interesantes en 3D (tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo. Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector. La señal se observa en un monitor de televisión. Los átomos del espécimen producen rayos X que también son detectados.

 

5.2.1.-Diseño del microscopio electrónico de transmisión

A partir del modelo construido por Knoll y Ruska en 1931 (fig.5-1), varias casas comerciales (RCA, Siemens, GE, entre otras) han producido diversos modelos de microscopios electrónicos modernos, pero todos ellos basados en el modelo original.

Conformación del microscopio electrónico de transmisión:

• Una cámara al vacío, el cual es generado por una bomba.

• Una columna donde se genera y viaja el haz de electrones.

• Un sistema óptico que forma una imagen en una pantalla fluorescente o en una placa fotográfica.

• Circuito electrónico estabilizador de voltaje.

Como se vio anteriormente, el haz de electrones se obtiene calentando el filamento del cátodo; los electrones se aceleran aplicando un voltaje entre el cátodo y el ánodo. El cátodo posee un potencial altamente negativo.

El sistema óptico consiste en un condensador que concentra y dirige el haz de electrones hacia el espécimen; una lente objetivo y otra lente proyectora, las cuales en conjunto producen una imagen aumentada que se proyecta en una pantalla fluorescente o una película fotográfica.

El espécimen se coloca en un dispositivo que permite moverlo en dos direcciones, en un plano perpendicular al plano del eje del microscopio. La columna posee un sistema de vaciado conectado a bombas de difusión o bombas mecánicas que crean el vacio.

El alto voltaje negativo aplicado al cátodo es producido por un circuito eléctrico de alto voltaje y las corrientes aplicadas a las lentes son producidas por circuitos de bajo voltaje. Las bombas de difusión e incluso las lentes (en ciertos modelos de microscopios) son enfriadas mediante un mecanismo de circulación de agua (14).

Figura 5-1.-El primer microscopio electrónico desarrollado por Knoll y Ruska (1931). (1) Tubo de descarga, (2) cátodo, (3) válvula, (4) espacio para lente electrostática (opcional), (5) lente magnética objetivo, (6) lente de proyección, (7) columna de alto vacío, (8) salida a la bomba de vacío, (9) caja de Faraday para medir la corriente del haz de electrones, (10) pantalla fluorescente o placa fotográfica, (11) válvula para medir el vacío, (12) apertura del ánodo, (13) aperturas o diafragmas, (14) válvula de vacío, (15) ventana de observación, (16) pantalla fluorescente removible para observación, (17) cámara. Nótese que este primer modelo carece de condensador. Modificado de Freundlich M. (1963) (20).

 

Elementos que conforman el microscopio electrónico de transmisión:

• Emisor de electrones:
Al igual que en el microscopio fotónico, la fuente de irradiación es pequeña, a partir de la cual se genera un estrecho haz de electrones. El haz de electrones de alta energía puede obtenerse de varias maneras (84):

- Por emisión termoiónica: Es la forma más común y se realiza a partir de un delgado filamento de tungsteno dispuesto en forma de V. El metal debe calentarse a una muy alta temperatura mediante una corriente eléctrica (muy alto voltaje) para acelerar a un número importante de electrones que se desprenderán de la punta de la V. Los electrones que se liberan tienden a formar una nube próxima a la superficie del metal y con la aplicación de un campo eléctrico entre el filamento (cátodo) y una porción de la columna (ánodo) los electrones son acelerados. Otros materiales pueden ser empleados en la confección del cátodo, tales como oxido de bario, platino, lantano, entre otros (fig. 5-2).

-Por emisión de campo: Se aplica un fuerte campo eléctrico (109 Vm) para extraer los electrones del filamento de metal (tungsteno). La temperatura es mucho menor que en la emisión termoiónica. Se obtiene un haz de electrones de mayor intensidad y se requiere de un vacío absoluto.

Figura 5-2.-Filamento de hexaboride de lantano LaB6. Tomada de The Electron Gun. Electron Microscopy (85).

 

• Condensador:
Con la introducción del condensador, conformado por una lente electromagnética, el haz de electrones puede ser enfocado de manera más precisa en el espécimen. La lente está colocada aproximadamente a media distancia entre el cátodo y el plano del objeto (equivalente a la platina en el microscopio fotónico). En algunos microscopios se coloca un doble condensador con la finalidad de lograr mayor resolución y aumento; de esta manera se reduce el riesgo de daño térmico y contaminación del espécimen. En la búsqueda de un mayor aumento, es necesario emplear un haz de electrones más potente e intenso, lo cual literalmente quema el espécimen, de allí que la observación deba hacerse rápidamente para que el tiempo de exposición a los electrones sea corto (14).

• Sistema óptico:
Un microscopio electrónico de transmisión funciona de manera análoga al microscopio de luz. En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de electrones aumentado y enfocado ya sea por lentes eléctricas (electrostáticas) o magnéticas (electromagnéticas). Un electrón al moverse por un campo magnético cambia su dirección y se desplaza en ángulo recto con respecto a la dirección del campo magnético. El grado de desviación es inversamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga del electrón. De igual manera, un electrón que se mueve en un campo eléctrico también cambia su dirección. Como resultado de la atracción entre una placa de carga positiva y la carga negativa del electrón, éste último es desviado hacia la placa. En consecuencia, hay dos vías para desviar los electrones con la finalidad de utilizarlos de manera análoga a un rayo de luz y producir una imagen aumentada de un objeto. Esto se logra mediante un campo eléctrico o mediante un campo electromagnético. Ambos tipos de campos serían empleados como “lentes”.

Los tipos de lentes empleadas en el microscopio electrónico obedecen entonces a dos modelos, las lentes electrostáticas y las lentes electromagnéticas. Durante años los fabricantes se han debatido entre ambos tipos de lentes, con la finalidad de demostrar cual lente era la más eficiente y daba mejores resultados. Los modelos electromagnéticos demostraron ser superiores (86).

Lentes electromagnéticas y aberraciones:
De manera simplificada se puede decir que las lentes electromagnéticas son electroimanes que están formados por un solenoide o bobina muy bien comprimida, constituida por un material conductor filamentoso, por el cual pasa una corriente eléctrica constante. El solenoide está alojado dentro de un contenedor de metal en forma de anillo, el cual posee una hendidura o ranura en su cara interna (fig. 5-3). El flujo magnético y las líneas de fuerza se concentran en la ranura y en el centro del anillo.

Propiedades de las lentes electromagnéticas: Las propiedades de las lentes son (14):
• Cada campo magnético posee una simetría axial y actúa como una lente para los electrones.
• Todas las lentes electromagnéticas son positivas.
• La velocidad de los electrones no se ve afectada.
• La imagen formada está rotada e invertida en relación al objeto.

Aberraciones: Las mismas aberraciones que afectan las lentes ópticas de cristal afectan la formación de las imágenes en las lentes electromagnéticas (14):

• Aberración de esfericidad: Es la más importante en la microscopía electrónica y es el factor que más limita el poder de resolución.
• Distorsión: Cambios en la imagen de la forma de los objetos (en barril, en almohadilla y distorsión espiral).
• Curvatura de campo.
• Astigmatismo.
• Aberraciones cromáticas: Originadas por variaciones en la velocidad de los electrones, los cuales pueden abandonar el cátodo emisor a diferentes velocidades, las cuales pueden ser modificadas al ser sometidos a la aceleración por la diferencia de voltaje.
• Otras: producidas por la rotación de los electrones al pasar por el campo magnético.

 

Figura 5-3.-Comparación entre una lente electromagnética y una lente de cristal. En la primera (izquierda) en corte longitudinal, una bobina de cobre (material conductor) está aislada en una cubierta de metal que posee una ranura en la cara interna (N-S). En la parte superior, la línea azul representa el objeto y en la parte inferior, la imagen del mismo obtenida por la lente. En amarillo se muestra el trayecto de electrones y fotones, dependiendo del tipo de lente. Modificado de Matter. Electromagnetic Lenses (87).

 

La mayoría de microscopios electrónicos emplean lentes electromagnéticas. Una razón de peso es que las lentes electrostáticas, en comparación a las magnéticas, son más sensibles a la calidad del vacío y limpieza de los componentes; de igual manera, en las primeras, algunas aberraciones son más severas y requieren de campos electrostáticos muy poderosos los cuales pueden ocasionar alteraciones eléctricas dentro de la columna del microscopio, afectando el haz de electrones.

El sistema óptico se emplea para producir una imagen del espécimen. Generalmente se colocan tres lentes (fig. 5-4):
- Lente objetivo: Es la más importante, pues determina el poder resolutivo del microscopio.
- Lente intermedia.
- Lente de proyección: En algunos casos es doble. La función de esta lente es la de producir el aumento final.

 

• Platina:
Cumple una función similar a la platina en el microscopio fotónico garantizando el intercambio de especímenes y el movimiento preciso del mismo durante la observación. En el microscopio electrónico de transmisión la platina es un dispositivo extraíble en el cual se coloca la rejilla de cobre sobre la cual se ha depositado el corte ultrafino del tejido. La platina debe conservarse muy limpia, de lo contrario se verá afectado el movimiento de la muestra, entorpeciendo la observación.

 

• Pantalla o visor y la cámara fotográfica:
La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energía cinética de los electrones se transforma en luz gracias a la fluorescencia. La pantalla consiste en una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc. Cada cristal es una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones y en consecuencia la resolución de la pantalla dependerá de la talla de los cristales (14).

Las imágenes pueden grabarse en una película fotográfica. Al igual que los fotones, los electrones al incidir sobre la emulsión fotográfica producen cambios en los cristales de bromuro de plata, obteniéndose un negativo en blanco y negro, que una vez revelado por métodos clásicos fotográficos puede ser copiado en papel. De esta manera se obtiene la microfotografía (micrografía) electrónica.

 

• Sistema de vacío:
Los electrones al chocar con las moléculas de aire se dispersan y luego de repetidas colisiones son detenidos. Esta dispersión puede arruinar las posibilidades de obtener imágenes bien definidas. Es por ello que el haz de electrones empleado en la microscopia electrónica debe viajar en un espacio al vacío, es decir, bien evacuado y sin moléculas de aire. La diferencia de alto voltaje entre el cátodo y el ánodo podría ocasionar descargas si existiera un número suficiente de moléculas de gas que facilitarían la ionización en este espacio. De allí que es necesario mantener una baja presión de gas en la cámara donde se encuentra el filamento emisor de electrones, lo cual a su vez alarga el tiempo de vida útil del mismo al prevenir la oxidación del filamento de tungsteno. Un vacío deficiente se identifica gracias a las descargas producidas.

La presión del aire en la columna del microscopio debe estar entre 10-4 a 10-5 mm Hg. Esto es considerado como alto vacío y se produce mediante el uso de bombas mecánicas que extraen el aire del interior de la columna del microscopio. Las bombas pueden ser de difusión en las cuales las moléculas de aire difunden en vapor de aceite y de mercurio (14).

Figura 5-4.-Izquierda: Modelo Philips moderno acoplado a una computadora. Derecha: Primer microscopio Electrónico de Transmisión del occidente del país, utilizado por el Dr. Julio M. Sosa en la Universidad de Los Andes. Tomado de The Electron Gun. Electron Microscopy. (85) y Oficina de Prensa Universidad de Los Andes. Centro Latinoamericano y del Caribe para la Investigación sobre la Enseñanza de la Ciencia (Celciec) y (88) respectivamente.

5.2.2.-Diseño del microscopio electrónico de barrido

Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los constituyentes celulares y aunque la tercera dimensión puede ser reconstruida a partir de cortes seriados, es un método largo y pesado. El microscopio electrónico de barrido permite la visualización de las muestras en 3D y el haz de electrones no atraviesa la muestra, por el contrario, incide sobre la superficie de la misma y los electrones secundarios son captados por un detector y la señal es enviada a una pantalla de televisión. La profundidad de campo obtenida por este microscopio es considerable; la imagen es constituida de zonas brillantes y zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional. Sin embargo, solamente la superficie puede ser observada. La técnica se emplea para estudiar células intactas y tejidos (21).

Componentes básicos del microscopio electrónico de barrido (fig. 5-5):
• Sistema de alto vacío.
• El filamento emisor de electrones (cátodo).
• Lentes (electromagnéticas, electrostáticas o superconductoras).
• Generador del escaneo: El haz de electrones es desplazado por la superficie del espécimen de una manera predeterminada.
• Detector de electrones secundarios.
• Pantalla de televisión.

Figura 5-5.-Diagrama esquemático que muestra los componentes fundamentales del microscopio electrónico de barrido. Modificado de Nixon W. The General Principles of Scanning Electron Microscopy (89).

 

El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la muestra genera electrones secundarios, los cuales se originan del espécimen y son colectados por un detector de electrones. Además de electrones secundarios, también se producen rayos X, infra-rojos, y ultravioleta (89).

El espécimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o rotado en varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de observación.

Otros accesorios pueden añadirse al microscopio, tales como computadoras para análisis directo, impresoras, videocámaras, circuito cerrado de televisión, entre otros (fig. 5-6).

Figura 5-6.-Microscopio electrónico de barrido. A la izquierda se aprecia el microscopio propiamente dicho, notablemente la columna y la cámara en la cual se coloca el espécimen. A la derecha los monitores acoplados para la observación de las imágenes en 3D. Tomado de The Science and Education Resource Center , Charleton College (90).

 

 

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5.3.- Formación de la imagen en los microscopios electrónicos

5.4.-Poder de resolución: Aumentos

5.5.-Preparación de los especímenes. Contraste. Aplicaciones

5.5.1.-Microscopía electrónica de transmisión

5.5.2.-Microscopía electrónica de barrido

5.6.-Microfotografía electrónica: Interpretación de las imágenes

5.7.-Semejanzas y diferencias entre la microscopía electrónica y la microscopia de luz