|
|
|
LA MICROSCOPÍA: HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS |
CAPÍTULO
5 5.1.-Nociones elementales
5.2.-Técnicas de microscopía electrónica El principio de la microscopía electrónica es muy similar al de la microscopia de luz y se han desarrollado dos principales técnicas (14):
5.2.1.-Diseño del microscopio electrónico de transmisión A partir
del modelo construido por Knoll y Ruska en 1931 (fig.5-1), varias casas
comerciales (RCA, Siemens, GE, entre otras) han producido diversos modelos
de microscopios electrónicos modernos, pero todos ellos basados
en el modelo original. • Una cámara al vacío, el cual es generado por una bomba. • Una columna donde se genera y viaja el haz de electrones. • Un sistema óptico que forma una imagen en una pantalla fluorescente o en una placa fotográfica. • Circuito electrónico estabilizador de voltaje. El sistema óptico consiste en un condensador que concentra y dirige el haz de electrones hacia el espécimen; una lente objetivo y otra lente proyectora, las cuales en conjunto producen una imagen aumentada que se proyecta en una pantalla fluorescente o una película fotográfica. El espécimen se coloca en un dispositivo que permite moverlo en dos direcciones, en un plano perpendicular al plano del eje del microscopio. La columna posee un sistema de vaciado conectado a bombas de difusión o bombas mecánicas que crean el vacio. El alto
voltaje negativo aplicado al cátodo es producido por un circuito
eléctrico de alto voltaje y las corrientes aplicadas a las lentes
son producidas por circuitos de bajo voltaje. Las bombas de difusión
e incluso las lentes (en ciertos modelos de microscopios) son enfriadas
mediante un mecanismo de circulación de agua (14). Figura 5-1.-El primer microscopio electrónico desarrollado por Knoll y Ruska (1931). (1) Tubo de descarga, (2) cátodo, (3) válvula, (4) espacio para lente electrostática (opcional), (5) lente magnética objetivo, (6) lente de proyección, (7) columna de alto vacío, (8) salida a la bomba de vacío, (9) caja de Faraday para medir la corriente del haz de electrones, (10) pantalla fluorescente o placa fotográfica, (11) válvula para medir el vacío, (12) apertura del ánodo, (13) aperturas o diafragmas, (14) válvula de vacío, (15) ventana de observación, (16) pantalla fluorescente removible para observación, (17) cámara. Nótese que este primer modelo carece de condensador. Modificado de Freundlich M. (1963) (20).
Elementos que conforman el microscopio electrónico de transmisión: •
Emisor de electrones: - Por emisión termoiónica: Es la forma más común y se realiza a partir de un delgado filamento de tungsteno dispuesto en forma de V. El metal debe calentarse a una muy alta temperatura mediante una corriente eléctrica (muy alto voltaje) para acelerar a un número importante de electrones que se desprenderán de la punta de la V. Los electrones que se liberan tienden a formar una nube próxima a la superficie del metal y con la aplicación de un campo eléctrico entre el filamento (cátodo) y una porción de la columna (ánodo) los electrones son acelerados. Otros materiales pueden ser empleados en la confección del cátodo, tales como oxido de bario, platino, lantano, entre otros (fig. 5-2). -Por emisión
de campo: Se aplica un fuerte campo eléctrico (109 Vm) para extraer
los electrones del filamento de metal (tungsteno). La temperatura es
mucho menor que en la emisión termoiónica. Se obtiene
un haz de electrones de mayor intensidad y se requiere de un vacío
absoluto. Figura 5-2.-Filamento de hexaboride de lantano LaB6. Tomada de The Electron Gun. Electron Microscopy (85).
•
Condensador: •
Sistema óptico: Los tipos de lentes empleadas en el microscopio electrónico obedecen entonces a dos modelos, las lentes electrostáticas y las lentes electromagnéticas. Durante años los fabricantes se han debatido entre ambos tipos de lentes, con la finalidad de demostrar cual lente era la más eficiente y daba mejores resultados. Los modelos electromagnéticos demostraron ser superiores (86). Lentes
electromagnéticas y aberraciones: Propiedades
de las lentes electromagnéticas: Las propiedades de
las lentes son (14):
•
Aberración de esfericidad: Es la más importante en la
microscopía electrónica y es el factor que más
limita el poder de resolución.
Figura 5-3.-Comparación entre una lente electromagnética y una lente de cristal. En la primera (izquierda) en corte longitudinal, una bobina de cobre (material conductor) está aislada en una cubierta de metal que posee una ranura en la cara interna (N-S). En la parte superior, la línea azul representa el objeto y en la parte inferior, la imagen del mismo obtenida por la lente. En amarillo se muestra el trayecto de electrones y fotones, dependiendo del tipo de lente. Modificado de Matter. Electromagnetic Lenses (87).
La mayoría de microscopios electrónicos emplean lentes electromagnéticas. Una razón de peso es que las lentes electrostáticas, en comparación a las magnéticas, son más sensibles a la calidad del vacío y limpieza de los componentes; de igual manera, en las primeras, algunas aberraciones son más severas y requieren de campos electrostáticos muy poderosos los cuales pueden ocasionar alteraciones eléctricas dentro de la columna del microscopio, afectando el haz de electrones. El sistema
óptico se emplea para producir una imagen del espécimen.
Generalmente se colocan tres lentes (fig. 5-4):
•
Pantalla o visor y la cámara fotográfica: Las imágenes pueden grabarse en una película fotográfica. Al igual que los fotones, los electrones al incidir sobre la emulsión fotográfica producen cambios en los cristales de bromuro de plata, obteniéndose un negativo en blanco y negro, que una vez revelado por métodos clásicos fotográficos puede ser copiado en papel. De esta manera se obtiene la microfotografía (micrografía) electrónica.
•
Sistema de vacío: La presión
del aire en la columna del microscopio debe estar entre 10-4 a 10-5
mm Hg. Esto es considerado como alto vacío y se produce mediante
el uso de bombas mecánicas que extraen el aire del interior de
la columna del microscopio. Las bombas pueden ser de difusión
en las cuales las moléculas de aire difunden en vapor de aceite
y de mercurio (14). Figura 5-4.-Izquierda: Modelo Philips moderno acoplado a una computadora. Derecha: Primer microscopio Electrónico de Transmisión del occidente del país, utilizado por el Dr. Julio M. Sosa en la Universidad de Los Andes. Tomado de The Electron Gun. Electron Microscopy. (85) y Oficina de Prensa Universidad de Los Andes. Centro Latinoamericano y del Caribe para la Investigación sobre la Enseñanza de la Ciencia (Celciec) y (88) respectivamente.
5.2.2.-Diseño del microscopio electrónico de barrido Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los constituyentes celulares y aunque la tercera dimensión puede ser reconstruida a partir de cortes seriados, es un método largo y pesado. El microscopio electrónico de barrido permite la visualización de las muestras en 3D y el haz de electrones no atraviesa la muestra, por el contrario, incide sobre la superficie de la misma y los electrones secundarios son captados por un detector y la señal es enviada a una pantalla de televisión. La profundidad de campo obtenida por este microscopio es considerable; la imagen es constituida de zonas brillantes y zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional. Sin embargo, solamente la superficie puede ser observada. La técnica se emplea para estudiar células intactas y tejidos (21).
Figura 5-5.-Diagrama esquemático que muestra los componentes fundamentales del microscopio electrónico de barrido. Modificado de Nixon W. The General Principles of Scanning Electron Microscopy (89).
El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la muestra genera electrones secundarios, los cuales se originan del espécimen y son colectados por un detector de electrones. Además de electrones secundarios, también se producen rayos X, infra-rojos, y ultravioleta (89). El espécimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o rotado en varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de observación. Otros accesorios
pueden añadirse al microscopio, tales como computadoras para
análisis directo, impresoras, videocámaras, circuito cerrado
de televisión, entre otros (fig. 5-6). Figura 5-6.-Microscopio electrónico de barrido. A la izquierda se aprecia el microscopio propiamente dicho, notablemente la columna y la cámara en la cual se coloca el espécimen. A la derecha los monitores acoplados para la observación de las imágenes en 3D. Tomado de The Science and Education Resource Center , Charleton College (90).
5.3.- Formación de la imagen en los microscopios electrónicos 5.4.-Poder de resolución: Aumentos 5.5.-Preparación de los especímenes. Contraste. Aplicaciones 5.5.1.-Microscopía electrónica de transmisión 5.5.2.-Microscopía electrónica de barrido 5.6.-Microfotografía electrónica: Interpretación de las imágenes 5.7.-Semejanzas y diferencias entre la microscopía electrónica y la microscopia de luz
|
|