Microscopía

CAPÍTULO 6
TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

6.2.-Microscopio de contraste de fase

6.4.-Microscopio de contraste por interferencia diferencial

6.5.-Microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.

Figura 6-21.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de Fluorescencia y fluorocromos (108).

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos:
• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente (tabla 6-1) (fig.6-22).

Fluorocromo	Longitud de onda de absorción (nm)	Longitud de onda de emisión (nm)
Cascade blue	374-403	422-430
Fluoresceína (FITC)	494	520
Rodamina (TRITC)	540	570
Naranja de acridina	460-502	526-650
Yoduro de propidio	536	617

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).

Figura 6-22.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La línea negra continua representa el espectro de excitación, la línea negra punteada muestra el espectro de emisión. La fluoresceína al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de 519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems (110).

También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia (21).

6.5.1.-Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos funcionan con epi-iluminación (13).

• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada (fig. 6-23).

• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

Figura 6-23.-Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. Tomada de wikipedia.org (111).

Los filtros empleados son útiles porque por ejemplo, cuando se emplea la fluoresceína, el espécimen se ilumina con una luz azul monocromática pura y filtrada. Para visualizarlo se emplea otro filtro el cual es completamente opaco a la luz azul pero deja pasar la luz verde (o amarilla y roja emitidas por otros fluorocromos). Las estructuras celulares marcadas mediante inmunofluorescencia aparecen iluminadas de verde contrastando con un fondo negro (fig. 6-24).

Figura 6-24.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm. Tomada de wikipedia.org (111).

6.5.2.-Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina (112, 113, 114):

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

6.6.-Microscopio de luz ultravioleta

6.7.-Microscopio confocal

6.8.-Otros tipos de microscopios